Monges rezam diante do túmulo do ex-imperador Carlos V (. O líder dos monges proclama que o imperador era orgulhoso, mas foi humilhado por erro.Carlo il sommo imperatore
Entra Dom Carlos, angustiado porque a mulher que ama agora é sua madrasta Io la vidi ai suo sorriso
Quando Carlos faz uma pausa em seu lamento, o líder dos monges proclama que a turbulência do mundo persiste até nos lugares sagrados; não podemos descansar, exceto no céu.
O som de sua voz assusta Carlos, que pensa ser parecido com o do imperador Carlos V. Carlos percebe ainda que o monge se parece fisicamente com o imperador, e se lembra de ter ouvido rumores de que o fantasma do imperador assombra o mosteiro.
Entra o querido amigo de Carlos, Rodrigo, Marquês de Posa, recém-chegado da oprimida terra de Flandres. Os dois se cumprimentam com alegria
Posa pede a ajuda do infante em nome dos que sofrem. Carlos revela que ama a madrasta. Posa primeiro fica chocado, mas depois simpático.
Ele encoraja Carlos a deixar a Espanha e ir para Flandres, e a esquecer sua dor concentrando-se na atividade política lá.
Os dois homens juram amizade eterna (Dueto: "Dio, che nell'alma infondere").
O rei Filipe e sua nova esposa, com seus assistentes, entram também para homenagear o túmulo de Carlos V, enquanto Dom Carlos lamenta o amor perdido. Io l' ho perduta!
A Princesa Eboli canta a Canção do Véu "Nel giardin del bello") sobre um rei mouro que tenta seduzir uma beleza velada atraente, que acaba por ser sua própria esposa abandonada.
Elisabeth entra. Posa dá-lhe uma carta da França, que contém um bilhete secreto de Don Carlos.
Por sua insistência "Carlo ch'è sol il nostro amore"), Elisabeth concorda em ver o Infante sozinha.
Sem saber dessa relação, Eboli infere que ela, Eboli, é quem Don Carlos ama
Quando ficam sozinhos, Don Carlos diz a Elisabeth que está infeliz e pede-lge que peça ao rei que o mande para Flandres.
Ela aceita prontamente, provocando Carlos a renovar suas declarações de amor, que ela piamente rejeita. Dom Carlos sai em frenesi, gritando que deve estar sob uma maldição. O Rei entra e fica com raiva porque a Rainha está sozinha e sem vigilância Perché qui sola è la Regina?
Suas suspeitas são um insulto para ela. Ele ordena que a dama de companhia que deveria atendê-la, a condessa de Aremberg, volte para a França, levando Elizabeth a cantar uma triste ária de despedida. Non pianger, mia compagna").
O rei aproxima-se de Posa, com cujo caráter e ativismo ele está impressionado, e se oferece para recompensá-lo por sua lealdade e serviço.
Posa implora ao rei que pare de oprimir o povo de Flandres. O rei chama o idealismo de Posa de irreal e avisa que o Grande Inquisidor o está observando.
O rei confidencia a Posa, dizendo-lhe que teme que Carlos esteja tendo um caso com Isabel. Posa responde que Carlos é inocente e se oferece para cuidar de Elisabeth e ser responsável por seu bom comportamento.
O rei aceita essa oferta com gratidão, e novamente avisa Posa para tomar cuidado com o Grande Inquisidor. Oso lo sguardo tuo penetrar
À meia-noite entra Dom Carlos com um bilhete que sugere um encontro nos jardins. Embora ele pense que isso seja de Elisabeth, na verdade é de Eboli. Eboli, que ainda acha que Dom Carlos a ama, entra. Don Carlos a confunde com Elisabeth no escuro, e apaixonadamente declara seu amor.
Quando ele vê o rosto de Eboli, percebe seu erro e recua Eboli adivinha seu segredo - que ele estava esperando a Rainha, a quem ele ama. Ameaça contar ao rei que Elisabeth e Carlos são amantes.
Carlos, apavorado, implora por misericórdia.
Posa entra e avisa para não cruzar com ele; ele é o confidente do rei. Eboli responde insinuando sombriamente que ela é uma inimiga formidável e perigosa, com um poder que Posa ainda não conhece.
(Seu poder é que ela está tendo um caso com o rei, mas ela não revelou isso ainda.)
Posa saca sua adaga pretende esfaqueá-la até a morte, mas reconsidera, poupa-a e declara sua confiança no Senhor. Eboli sai com uma raiva vingativa. Posa aconselha Carlos a confiar-lhe todos os documentos políticos sensíveis e potencialmente incriminadores que possa ter e, quando Carlos concorda, eles reafirmam sua amizade.
Cena 2: Em frente à Catedral de Valladolid
Preparativos estão sendo feitos para um auto-da-fé, o desfile público e queima de hereges condenados. Enquanto o povo celebra, os monges arrastam os condenados para a pilha de lenha. Uma procissão real segue, e o rei se dirige à população, prometendo protegê-los com fogo e espada.
Dom Carlos entra com seis enviados flamengos, que rogam ao Rei a liberdade do seu país.
Embora o povo e a corte sejam simpáticos, o rei, apoiado pelos monges, ordena que seus guardas prendam os enviados.
Carlos exige que o rei lhe conceda autoridade para governar Flandres; o rei recusa desdenhosamente.
Enfurecido, Carlos puxa sua espada contra o rei. O rei pede ajuda, mas os guardas não atacam Don Carlos. Posa percebe que atacar o rei seria desastroso para Carlos. Ele dá um passo à frente e desarma a situação tirando a espada a Carlos.
Carlos, espantado cede ao amigo sem resistir. Aliviado e grato, o rei eleva Posa ao posto de duque. Os guardas prendem Carlos, os monges atiram fogo na pilha de lenha, e quando as chamas começam a subir, uma voz celestial pode ser ouvida prometendo paz celestial às almas condenadas
